Inhibitory nieodwracalne reagują z enzymem, wiążąc się kowalencyjnie, tudzież zatem nieodwracalnie, do jego łańcuchów białkowych. Taka inhibicja trwale unieczynnia daną cząsteczkę enzymu. Do inhibitorów tego typu powinno się eflornityna, lekarstwo stosowany w środku pasożytniczej chorobie - śpiączce afrykańskiej[66]. Również penicylina oraz polopiryna mają pokrewny mechanizm działania. Inhibitory te wstępnie, do tej pory nie kowalencyjnie, wiążą się z miejscami aktywnymi enzymów, po czym tylko działanie enzymu przekształca je do wnętrza reaktywne formy, które wiążą się nieodwracalnie z jedną czy więcej resztami aminokwasowymi, blokując enzym.