Silnie związane z enzymem grupy prostetyczne występują zwykle w środku jego miejscu aktywnym także są zgoła zaangażowane wewnątrz katalizę plus nie opuszczają miejsca aktywnego w czasie reakcji. Na przypadek flawinowe również hemowe kofaktory biorą wkład do wnętrza reakcjach redoks.
Większość kofaktorów nie jest kowalencyjnie powiązana z enzymem. Jednakże organiczne grupy prostetyczne mogą się oprawić kowalencyjnie np. pirofosforan tiaminy do wnętrza dehydrogenazie pirogronianowej.